En esta ultima seccion, haremos una demostración de como utilizar datos de ONT despues de que estos hayan sido corregidos y filtrados. Tal vez una de las aplicaciones mas usadas de datos nanopore "in-situ" es el de la identificacion de organismos mediante metodos de alineamiento, e.g. usando BLAST. En este ejercicio, ejecutaremos una busqueda de secuencias producidas a partir de un organismos misterioso, encontradoen las vicinidades del jardin botanico Kew. Intentaremos determinar su identidad buscando en una base de datos predeterminada. Para esto ejecutaremos busquedas locales creando bases de datos en makebklastdb y magicblast. Ejemplos de comandos:
makeblastdb -in refgenomes_org.test.fasta -out refgenomes_org.test_refDB -parse_seqids -dbtype nucl
magicblast -query archivo_fastq -db refgenomes_org.test_refDB -out ab.out -outfmt tabular -no_unaligned -infmt fastqPero tambien ejectuaremos busquedas en NCBI (nu dbase) de manera remota (importante tener acceso a un NCBI API KEY, accessible desde la cuenta individual NCBI de cada uno):
export NCBI_API_KEY=09ddca88b438c887b83f8d58fcc890c321XX
blastn -query misterious_seqs.ONT.fasta -db nt -remote -task blastn-short -evalue 0.01 -entrez_query "Asparagales [organism]" -outfmt 6 -out blast_result_misteriousplant.table -max_target_seqs 10 -max_hsps 5El output de este comando se ve asi:
93c9b0d6-2802-485b-8998-435462f77771 MW375124.1 93.294 1178 39 13 34 1190 71181 70023 0.0 1659
93c9b0d6-2802-485b-8998-435462f77771 MW375125.1 93.248 1170 48 12 34 1190 71757 70606 0.0 1635
93c9b0d6-2802-485b-8998-435462f77771 NC_043905.1 93.469 1133 42 12 76 1190 70163 69045 0.0 1604
93c9b0d6-2802-485b-8998-435462f77771 MW375128.1 92.760 1174 53 12 34 1189 72076 70917 0.0 1598
93c9b0d6-2802-485b-8998-435462f77771 MW375126.1 93.412 1108 47 11 101 1190 71407 70308 0.0 1560
231acd9d-2063-4509-9ccc-c822ff4f66d7 MF861028.1 94.057 774 23 6 33 799 758 1 0.0 1156
231acd9d-2063-4509-9ccc-c822ff4f66d7 MF861030.1 93.928 774 23 7 33 799 757 1 0.0 1140
231acd9d-2063-4509-9ccc-c822ff4f66d7 MF861029.1 93.928 774 23 7 33 799 757 1 0.0 1140
231acd9d-2063-4509-9ccc-c822ff4f66d7 MF860862.1 94.802 731 22 5 33 756 737 16 0.0 1130
231acd9d-2063-4509-9ccc-c822ff4f66d7 MF860864.1 94.665 731 22 6 33 756 736 16 0.0 1114
0d3193bd-6dca-4f57-bf00-665e9cc55904 MW375130.1 97.489 1314 20 7 30 1339 36038 37342 0.0 2300
0d3193bd-6dca-4f57-bf00-665e9cc55904 MW375125.1 97.184 1314 22 7 31 1339 36381 37684 0.0 2272
0d3193bd-6dca-4f57-bf00-665e9cc55904 MW375127.1 97.260 1314 22 8 31 1339 36864 38168 0.0 2268
0d3193bd-6dca-4f57-bf00-665e9cc55904 NC_043905.1 97.108 1314 24 8 31 1339 35271 36575 0.0 2252
0d3193bd-6dca-4f57-bf00-665e9cc55904 MH979332.1 97.108 1314 24 8 31 1339 35271 36575 0.0 2252
44e5b206-fb13-48d7-9cdc-0b2c51fdc921 KP205432.1 94.507 1693 38 32 27 1683 92658 90985 0.0 2411
44e5b206-fb13-48d7-9cdc-0b2c51fdc921 KP205432.1 94.507 1693 38 32 27 1683 149723 151396 0.0 2411
44e5b206-fb13-48d7-9cdc-0b2c51fdc921 MW375129.1 94.507 1693 38 32 27 1683 92824 91151 0.0 2411
44e5b206-fb13-48d7-9cdc-0b2c51fdc921 MW375129.1 94.507 1693 38 32 27 1683 149917 151590 0.0 2411
44e5b206-fb13-48d7-9cdc-0b2c51fdc921 MW375125.1 94.507 1693 38 32 27 1683 92767 91094 0.0 2411
44e5b206-fb13-48d7-9cdc-0b2c51fdc921 MW375125.1 94.507 1693 38 32 27 1683 149860 151533 0.0 2411
44e5b206-fb13-48d7-9cdc-0b2c51fdc921 MW375130.1 94.448 1693 39 32 27 1683 91332 89659 0.0 2403
44e5b206-fb13-48d7-9cdc-0b2c51fdc921 MW375130.1 94.448 1693 39 32 27 1683 142685 144358 0.0 2403
44e5b206-fb13-48d7-9cdc-0b2c51fdc921 MW375124.1 93.938 1699 42 31 27 1683 92255 90576 0.0 2365
44e5b206-fb13-48d7-9cdc-0b2c51fdc921 MW375124.1 93.938 1699 42 31 27 1683 146901 148580 0.0 2365
b20fe3db-c68c-4c1f-9a3b-c3b27ee92a6d LC193510.1 97.478 1705 15 11 22 1703 105931 104232 0.0 2985
b20fe3db-c68c-4c1f-9a3b-c3b27ee92a6d LC193510.1 97.478 1705 15 11 22 1703 129447 131146 0.0 2985
b20fe3db-c68c-4c1f-9a3b-c3b27ee92a6d NC_044644.1 96.487 1708 24 14 22 1703 104417 102720 0.0 2843
b20fe3db-c68c-4c1f-9a3b-c3b27ee92a6d NC_044644.1 96.487 1708 24 14 22 1703 132888 134585 0.0 2843
Por ultimo, ensamblar genomas con datos ONT ya corregidos es bastante sencillo, dependiendo de que algoritmo se use. En nuestro caso, ejecutaremos SMARTdenovo:
/home/siriusb/softwares/genomics/smartdenovo/smartdenovo.pl -c 1 -t 64 -p prefijo_output /directorio/archivos/fastq.fastq > prefijo_output.mak
make -f *.makLos archivos base para ejecutar este comando se encuentran en la caperta NGSdat de este repositorio. Adicionalmente, favor descargar los archivos fasta disponibles en esta liga: https://drive.google.com/drive/folders/1zTgYw0CjRzhMqDqoMHpDEdq21G8P1ARv?usp=share_link