From 21904e98cf3bf9f1a7e28ef27452796476ec2c08 Mon Sep 17 00:00:00 2001
From: bobvh <1587584+bobvh@users.noreply.github.com>
Date: Mon, 21 Oct 2024 14:56:32 -0400
Subject: [PATCH 1/2] Confirmed bug fixes and fixed vg output
---
.../combinatorial_design.md | 127 +++++++++
.../combinatorial_plasmid_design/design.csv | 5 +
.../combinatorial_plasmid_design/library.gfa | 39 +++
.../combinatorial_plasmid_design/library.svg | 253 ++++++++++++++++++
.../library_fixed.svg | 253 ++++++++++++++++++
.../combinatorial_plasmid_design/parts.fa | 18 ++
.../combinatorial_plasmid_design/puc19.fa | 41 +++
7 files changed, 736 insertions(+)
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/combinatorial_design.md
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/design.csv
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/library.gfa
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/library.svg
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/library_fixed.svg
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/parts.fa
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/puc19.fa
diff --git a/examples/combinatorial_plasmid_design/combinatorial_design.md b/examples/combinatorial_plasmid_design/combinatorial_design.md
new file mode 100644
index 0000000..a9dbbdc
--- /dev/null
+++ b/examples/combinatorial_plasmid_design/combinatorial_design.md
@@ -0,0 +1,127 @@
+# Combinatorial plasmid design
+
+In this example we will design a library of expression plasmids for _E. coli_. We are looking for the combination of promoter and ribosome binding site that result in the highest expression of an insulin precursor peptide.
+
+We start by setting up a new gen repository and a default database and collection name. This way we don't have to keep specifying which database file and collection to use in the `gen import` and `gen update` commands.
+
+```console
+bvh@mbp:~$ gen init
+
+Gen repository initialized.
+```
+``` console
+bvh@mbp:~$ gen defaults --database insulin.db --collection plasmids
+
+Default database set to insulin.db
+Default collection set to plasmids
+```
+
+Next, we import our base vector from a fasta file.
+``` console
+bvh@mbp:~$ gen import --fasta puc19.fa
+
+Created it
+```
+
+By importing the sequence we have created one new block group and one new path. These are comprised of two edges from the source node to the start of the imported sequence node, and from the end of the imported sequence node to the sink node. We can verify this by querying the database _(todo: implement this functionality in gen)_.
+```console
+bvh@mbp:~$ sqlite3 --header insulin.db
+
+SQLite version 3.39.5 2022-10-14 20:58:05
+Enter ".help" for usage hints.
+
+sqlite> select * from block_group;
+id|collection_name|sample_name|name
+1|plasmids||M77789.2
+
+sqlite> select * from path;
+id|block_group_id|name
+1|1|M77789.2
+
+sqlite> select * from edges;
+id|source_node_id|source_coordinate|source_strand|target_node_id|target_coordinate|target_strand|chromosome_index|phased
+1|1|0|+|3|0|+|0|0
+2|3|2686|+|2|0|+|0|0
+
+sqlite> .quit
+```
+
+We see that both the path and the block group are called M77789.2, is accession ID for the pUC19 plasmid, which was extracted from the fasta header. Next, we will prepare a _gen update_ operation to insert the insulin operon variants into the vector, more specifically between position 106 and 539. We need two files to specify the design: a _parts_ file that contains the sequences of all of the genetic parts that go into the design, and a _library_ file that describes how the parts should be arranged.
+
+The library file is a simple CSV table without headers, where each column represents a 'slot' in the construct, and the rows represent the possible parts to include in each slot. Gen will create a combinatorial design where all options for each slot are combined with all options for the other slots. In the example below we have 3 slots, with respectively 5, 2, and 1 part options, this results in 10 possible outcomes (5x2x1).
+
+
+design.csv
+
+BBa_J23100
+BBa_B0030
+proinsulin
+
+
+BBa_J23101
+BBa_B0032
+
+
+
+BBa_J23102
+BBa_B0034
+
+
+
+BBa_J23103
+
+
+
+
+BBa_J23104
+
+
+
+
+
+If you create this file by hand outside of a spreadsheet program, please ensure that empty cells are still be separated by commas. We can then run the update operation using the following command:
+
+
+```console
+bvh@mbp:~$ gen update --path-name M77789.2 --start 106 --end 539 --library design.csv --parts parts.fa
+```
+
+This update operation did not create new block groups or paths, it only created new edges in the existing block group. You can verify this by running the queries described above, or by rendering a graphical representation of the block group.
+
+## Visualizing the library
+We start by exporting our block group to a GFA file that can be used by graph handling software like vg. The gen 'export' command can take a sample name as argument if you only want to export the block group associated with a specific sample, but in this case we just have one block group and it is not associated with any sample.
+
+```console
+bvh@mbp:~$ gen export --gfa library.gfa
+```
+
+We will use the vg tools using Docker, which we will start as follows to automatically download the vg Docker image, and bind the current working directory to the /data directory in the Docker container.
+
+```console
+bvh@mbp:~$ docker run --volume $PWD:/data --workdir /data --interactive -t quay.io/vgteam/vg:v1.60.0
+```
+
+Once we're inside the container, we still have to install the graphviz suite to render our images to SVG format.
+
+```console
+root@e97629b542ca:/vg# apt install -y graphviz
+```
+
+Then we run `vg view` and pipe its output to the `dot` program, which was installed as part of graphviz.
+```console
+root@e97629b542ca:/vg# vg view --gfa-in library.gfa --dot --color --simple-dot | dot -Tsvg -o library.svg
+```
+
+This results in the following image, in which the new nodes are highlighted in red. Nodes 1, 9, and 3 are the promoters; nodes 7, 8 and 2 are ribosome binding sites. The original pUC19 sequence is also visible as the path over nodes [4, 5, 6].
+![visual representation of the graph](./library.svg)
+
+Note that VG uses its own numbering for the nodes. To find out which gen nodes these correspond to, run the following series of commands instead:
+
+```console
+root@e97629b542ca:/vg# vg convert --gfa-in library.gfa --gfa-trans translation_table.txt --vg-out | vg view --vg-in - --dot --color --simple-dot | dot -Tsvg -o library.svg
+root@e97629b542ca:/vg# cp library.svg library_fixed.svg && while IFS=$'\t' read _ new old; do sed "s#font-size=\"14.00\">$old#font-size=\"14.00\">$new#g" library_fixed.svg > temp_file.html && mv temp_file.html library_fixed.svg; done < translation_table.txt
+```
+
+This results in the following output, where the nodes are referred to by their gen identifier in the block graph model used when exporting to GFA. In this model, nodes are identified by two numbers separated by a period: the first number is the original node identifier in the regular gen model, the number behind the period is the coordinate to where the block starts. Since we asked to insert the library from coordinate 106 to 539 on the reference path, node 3 is split up into 3.0, 3.106 and 3.159 in the block graph model.
+![visual representation with the actual node IDs](./library_fixed.svg)
+
diff --git a/examples/combinatorial_plasmid_design/design.csv b/examples/combinatorial_plasmid_design/design.csv
new file mode 100644
index 0000000..14279b7
--- /dev/null
+++ b/examples/combinatorial_plasmid_design/design.csv
@@ -0,0 +1,5 @@
+BBa_J23100,BBa_B0030,proinsulin
+BBa_J23101,BBa_B0032,
+BBa_J23102,BBa_B0034,
+BBa_J23103,,
+BBa_J23104,,
diff --git a/examples/combinatorial_plasmid_design/library.gfa b/examples/combinatorial_plasmid_design/library.gfa
new file mode 100644
index 0000000..0622ff4
--- /dev/null
+++ b/examples/combinatorial_plasmid_design/library.gfa
@@ -0,0 +1,39 @@
+S 6.0 tttacagctagctcagtcctaggtattatgctagc *
+S 11.0 TCTAGAGTCACACAGGAAAGTACTAG *
+S 4.0 atgcgcttcgtcaatcagcacctttgtggttctcacctcgttgaggctttgtaccttgtttgcggtgaacgtggtttcttctacactcctaagactcgcgaggcagaggacctgcaagtggggcaggtggagctgggcgggggccctggtgcaggcagcctgcaacccttggccctggaggggtccctgcaacgtggcattgtggaacaatgctgtaccagcatctgctccctctaccagctggagaactactgcaactaataa *
+S 8.0 ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagc *
+S 5.0 ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc *
+S 3.0 GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATT *
+S 3.106 AATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAG *
+S 3.539 TTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA *
+S 10.0 TCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAG *
+S 12.0 TCTAGAGATTAAAGAGGAGAAATACTAG *
+S 7.0 ttgacagctagctcagtcctaggtactgtgctagc *
+S 9.0 ttgacagctagctcagtcctaggtattgtgctagc *
+L 9.0 + 10.0 + 0M
+L 3.0 + 8.0 + 0M
+L 7.0 + 12.0 + 0M
+L 3.0 + 9.0 + 0M
+L 9.0 + 11.0 + 0M
+L 7.0 + 11.0 + 0M
+L 8.0 + 10.0 + 0M
+L 3.0 + 7.0 + 0M
+L 10.0 + 4.0 + 0M
+L 4.0 + 3.539 + 0M
+L 8.0 + 12.0 + 0M
+L 5.0 + 11.0 + 0M
+L 6.0 + 12.0 + 0M
+L 12.0 + 4.0 + 0M
+L 9.0 + 12.0 + 0M
+L 5.0 + 10.0 + 0M
+L 6.0 + 11.0 + 0M
+L 8.0 + 11.0 + 0M
+L 6.0 + 10.0 + 0M
+L 7.0 + 10.0 + 0M
+L 3.0 + 5.0 + 0M
+L 5.0 + 12.0 + 0M
+L 3.0 + 6.0 + 0M
+L 11.0 + 4.0 + 0M
+L 3.0 + 3.106 + 0M
+L 3.106 + 3.539 + 0M
+P M77789.2 3.0+,3.106+,3.539+ *
diff --git a/examples/combinatorial_plasmid_design/library.svg b/examples/combinatorial_plasmid_design/library.svg
new file mode 100644
index 0000000..069814d
--- /dev/null
+++ b/examples/combinatorial_plasmid_design/library.svg
@@ -0,0 +1,253 @@
+
+
+
+
+
+
+graphname
+
+
+
+1
+
+1
+35 bp
+
+
+
+2
+
+2
+26 bp
+
+
+
+1->2
+
+
+
+
+
+9
+
+9
+25 bp
+
+
+
+1->9
+
+
+
+
+
+10
+
+10
+28 bp
+
+
+
+1->10
+
+
+
+
+
+3
+
+3
+264 bp
+
+
+
+2->3
+
+
+
+
+
+8
+
+8
+2147 bp
+
+
+
+3->8
+
+
+
+
+
+4
+
+4
+35 bp
+
+
+
+4->2
+
+
+
+
+
+4->9
+
+
+
+
+
+4->10
+
+
+
+
+
+5
+
+5
+35 bp
+
+
+
+5->2
+
+
+
+
+
+5->9
+
+
+
+
+
+5->10
+
+
+
+
+
+6
+
+6
+106 bp
+
+
+
+6->1
+
+
+
+
+
+6->4
+
+
+
+
+
+6->5
+
+
+
+
+
+7
+
+7
+433 bp
+
+
+
+6->7
+
+
+
+
+
+11
+
+11
+35 bp
+
+
+
+6->11
+
+
+
+
+
+12
+
+12
+35 bp
+
+
+
+6->12
+
+
+
+
+
+7->8
+
+
+
+
+
+9->3
+
+
+
+
+
+10->3
+
+
+
+
+
+11->2
+
+
+
+
+
+11->9
+
+
+
+
+
+11->10
+
+
+
+
+
+12->2
+
+
+
+
+
+12->9
+
+
+
+
+
+12->10
+
+
+
+
+
diff --git a/examples/combinatorial_plasmid_design/library_fixed.svg b/examples/combinatorial_plasmid_design/library_fixed.svg
new file mode 100644
index 0000000..e82866c
--- /dev/null
+++ b/examples/combinatorial_plasmid_design/library_fixed.svg
@@ -0,0 +1,253 @@
+
+
+
+
+
+
+graphname
+
+
+
+1
+
+6.0
+35 bp
+
+
+
+2
+
+11.0
+26 bp
+
+
+
+1->2
+
+
+
+
+
+9
+
+10.0
+25 bp
+
+
+
+1->9
+
+
+
+
+
+10
+
+12.0
+28 bp
+
+
+
+1->10
+
+
+
+
+
+3
+
+4.0
+264 bp
+
+
+
+2->3
+
+
+
+
+
+8
+
+3.539
+2147 bp
+
+
+
+3->8
+
+
+
+
+
+4
+
+8.0
+35 bp
+
+
+
+4->2
+
+
+
+
+
+4->9
+
+
+
+
+
+4->10
+
+
+
+
+
+5
+
+5.0
+35 bp
+
+
+
+5->2
+
+
+
+
+
+5->9
+
+
+
+
+
+5->10
+
+
+
+
+
+6
+
+3.0
+106 bp
+
+
+
+6->1
+
+
+
+
+
+6->4
+
+
+
+
+
+6->5
+
+
+
+
+
+7
+
+3.106
+433 bp
+
+
+
+6->7
+
+
+
+
+
+11
+
+7.0
+35 bp
+
+
+
+6->11
+
+
+
+
+
+12
+
+9.0
+35 bp
+
+
+
+6->12
+
+
+
+
+
+7->8
+
+
+
+
+
+9->3
+
+
+
+
+
+10->3
+
+
+
+
+
+11->2
+
+
+
+
+
+11->9
+
+
+
+
+
+11->10
+
+
+
+
+
+12->2
+
+
+
+
+
+12->9
+
+
+
+
+
+12->10
+
+
+
+
+
diff --git a/examples/combinatorial_plasmid_design/parts.fa b/examples/combinatorial_plasmid_design/parts.fa
new file mode 100644
index 0000000..ede05cc
--- /dev/null
+++ b/examples/combinatorial_plasmid_design/parts.fa
@@ -0,0 +1,18 @@
+>proinsulin BBa_K2417006
+atgcgcttcgtcaatcagcacctttgtggttctcacctcgttgaggctttgtaccttgtttgcggtgaacgtggtttcttctacactcctaagactcgcgaggcagaggacctgcaagtggggcaggtggagctgggcgggggccctggtgcaggcagcctgcaacccttggccctggaggggtccctgcaacgtggcattgtggaacaatgctgtaccagcatctgctccctctaccagctggagaactactgcaactaataa
+>BBa_J23100
+ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc
+>BBa_J23101
+tttacagctagctcagtcctaggtattatgctagc
+>BBa_J23102
+ttgacagctagctcagtcctaggtactgtgctagc
+>BBa_J23103
+ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagc
+>BBa_J23104
+ttgacagctagctcagtcctaggtattgtgctagc
+>BBa_B0034
+TCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAG
+>BBa_B0032
+TCTAGAGTCACACAGGAAAGTACTAG
+>BBa_B0030
+TCTAGAGATTAAAGAGGAGAAATACTAG
diff --git a/examples/combinatorial_plasmid_design/puc19.fa b/examples/combinatorial_plasmid_design/puc19.fa
new file mode 100644
index 0000000..4c96650
--- /dev/null
+++ b/examples/combinatorial_plasmid_design/puc19.fa
@@ -0,0 +1,41 @@
+>M77789.2 Cloning vector pUC19, complete sequence
+GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTT
+CCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGG
+CTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAA
+CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAG
+CTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGC
+CTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAAC
+AGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTC
+ACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCG
+CCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCG
+TCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGT
+GATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGG
+GGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGAC
+AATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGC
+CCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAA
+GATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTG
+AGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATT
+ATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAG
+TACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAA
+CCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTT
+TTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCA
+AACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAAC
+TACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT
+GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGT
+ATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGG
+CAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTC
+AGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTG
+AAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACC
+CCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAA
+AAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACT
+GGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGA
+ACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAA
+GTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGG
+GGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTAT
+GAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGG
+AGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTC
+TGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGG
+CCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTC
+TGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGC
+GAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA
+
From 79fece4f0ed498754d29dec8931e8d7a58237643 Mon Sep 17 00:00:00 2001
From: bobvh <1587584+bobvh@users.noreply.github.com>
Date: Wed, 23 Oct 2024 11:49:08 -0400
Subject: [PATCH 2/2] NGS analysis
---
.../combinatorial_design.md | 167 +-
.../combinatorial_plasmid_design/sample1.fq | 40 +
.../combinatorial_plasmid_design/sample1.gaf | 10 +
.../combinatorial_plasmid_design/sample2.fq | 4000 +++++++++++++++++
.../combinatorial_plasmid_design/sample2.gaf | 1000 +++++
5 files changed, 5203 insertions(+), 14 deletions(-)
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/sample1.fq
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/sample1.gaf
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/sample2.fq
create mode 100644 examples/combinatorial_plasmid_design/sample2.gaf
diff --git a/examples/combinatorial_plasmid_design/combinatorial_design.md b/examples/combinatorial_plasmid_design/combinatorial_design.md
index a9dbbdc..6268838 100644
--- a/examples/combinatorial_plasmid_design/combinatorial_design.md
+++ b/examples/combinatorial_plasmid_design/combinatorial_design.md
@@ -1,8 +1,10 @@
# Combinatorial plasmid design
-In this example we will design a library of expression plasmids for _E. coli_. We are looking for the combination of promoter and ribosome binding site that result in the highest expression of an insulin precursor peptide.
+In this example we will design a library of expression plasmids for _E. coli_. We are looking for the combination of
+promoter and ribosome binding site that result in the highest expression of an insulin precursor peptide.
-We start by setting up a new gen repository and a default database and collection name. This way we don't have to keep specifying which database file and collection to use in the `gen import` and `gen update` commands.
+We start by setting up a new gen repository and a default database and collection name. This way we don't have to keep
+specifying which database file and collection to use in the `gen import` and `gen update` commands.
```console
bvh@mbp:~$ gen init
@@ -23,7 +25,9 @@ bvh@mbp:~$ gen import --fasta puc19.fa
Created it
```
-By importing the sequence we have created one new block group and one new path. These are comprised of two edges from the source node to the start of the imported sequence node, and from the end of the imported sequence node to the sink node. We can verify this by querying the database _(todo: implement this functionality in gen)_.
+By importing the sequence we have created one new block group and one new path. These are comprised of two edges from
+the source node to the start of the imported sequence node, and from the end of the imported sequence node to the sink
+node. We can verify this by querying the database _(todo: implement this functionality in gen)_.
```console
bvh@mbp:~$ sqlite3 --header insulin.db
@@ -46,9 +50,16 @@ id|source_node_id|source_coordinate|source_strand|target_node_id|target_coordina
sqlite> .quit
```
-We see that both the path and the block group are called M77789.2, is accession ID for the pUC19 plasmid, which was extracted from the fasta header. Next, we will prepare a _gen update_ operation to insert the insulin operon variants into the vector, more specifically between position 106 and 539. We need two files to specify the design: a _parts_ file that contains the sequences of all of the genetic parts that go into the design, and a _library_ file that describes how the parts should be arranged.
+We see that both the path and the block group are called M77789.2, is accession ID for the pUC19 plasmid, which was
+extracted from the fasta header. Next, we will prepare a _gen update_ operation to insert the insulin operon variants
+into the vector, more specifically between position 106 and 539. We need two files to specify the design: a _parts_ file
+that contains the sequences of all of the genetic parts that go into the design, and a _library_ file that describes how
+the parts should be arranged.
-The library file is a simple CSV table without headers, where each column represents a 'slot' in the construct, and the rows represent the possible parts to include in each slot. Gen will create a combinatorial design where all options for each slot are combined with all options for the other slots. In the example below we have 3 slots, with respectively 5, 2, and 1 part options, this results in 10 possible outcomes (5x2x1).
+The library file is a simple CSV table without headers, where each column represents a 'slot' in the construct, and the
+rows represent the possible parts to include in each slot. Gen will create a combinatorial design where all options for
+each slot are combined with all options for the other slots. In the example below we have 3 slots, with respectively 5,
+2, and 1 part options, this results in 10 possible outcomes (5x2x1).
design.csv
@@ -79,23 +90,29 @@ The library file is a simple CSV table without headers, where each column repres
-If you create this file by hand outside of a spreadsheet program, please ensure that empty cells are still be separated by commas. We can then run the update operation using the following command:
+If you create this file by hand outside of a spreadsheet program, please ensure that empty cells are still be separated
+by commas. We can then run the update operation using the following command:
```console
bvh@mbp:~$ gen update --path-name M77789.2 --start 106 --end 539 --library design.csv --parts parts.fa
```
-This update operation did not create new block groups or paths, it only created new edges in the existing block group. You can verify this by running the queries described above, or by rendering a graphical representation of the block group.
+This update operation did not create new block groups or paths, it only created new edges in the existing block group.
+You can verify this by running the queries described above, or by rendering a graphical representation of the block
+group.
## Visualizing the library
-We start by exporting our block group to a GFA file that can be used by graph handling software like vg. The gen 'export' command can take a sample name as argument if you only want to export the block group associated with a specific sample, but in this case we just have one block group and it is not associated with any sample.
+We start by exporting our block group to a GFA file that can be used by graph handling software like vg. The gen
+'export' command can take a sample name as argument if you only want to export the block group associated with a
+specific sample, but in this case we just have one block group and it is not associated with any sample.
```console
bvh@mbp:~$ gen export --gfa library.gfa
```
-We will use the vg tools using Docker, which we will start as follows to automatically download the vg Docker image, and bind the current working directory to the /data directory in the Docker container.
+We will use the vg tools using Docker, which we will start as follows to automatically download the vg Docker image, and
+bind the current working directory to the /data directory in the Docker container.
```console
bvh@mbp:~$ docker run --volume $PWD:/data --workdir /data --interactive -t quay.io/vgteam/vg:v1.60.0
@@ -112,16 +129,138 @@ Then we run `vg view` and pipe its output to the `dot` program, which was instal
root@e97629b542ca:/vg# vg view --gfa-in library.gfa --dot --color --simple-dot | dot -Tsvg -o library.svg
```
-This results in the following image, in which the new nodes are highlighted in red. Nodes 1, 9, and 3 are the promoters; nodes 7, 8 and 2 are ribosome binding sites. The original pUC19 sequence is also visible as the path over nodes [4, 5, 6].
-![visual representation of the graph](./library.svg)
+This results in the following image, in which the new nodes are highlighted in red. Nodes 1, 9, and 3 are the promoters;
+nodes 7, 8 and 2 are ribosome binding sites. The original pUC19 sequence is also visible as the path over nodes [4, 5,
+6]. ![visual representation of the graph](./library.svg)
-Note that VG uses its own numbering for the nodes. To find out which gen nodes these correspond to, run the following series of commands instead:
+Note that VG uses its own numbering for the nodes. To find out which gen nodes these correspond to, run the following
+series of commands instead:
```console
root@e97629b542ca:/vg# vg convert --gfa-in library.gfa --gfa-trans translation_table.txt --vg-out | vg view --vg-in - --dot --color --simple-dot | dot -Tsvg -o library.svg
root@e97629b542ca:/vg# cp library.svg library_fixed.svg && while IFS=$'\t' read _ new old; do sed "s#font-size=\"14.00\">$old#font-size=\"14.00\">$new#g" library_fixed.svg > temp_file.html && mv temp_file.html library_fixed.svg; done < translation_table.txt
```
-This results in the following output, where the nodes are referred to by their gen identifier in the block graph model used when exporting to GFA. In this model, nodes are identified by two numbers separated by a period: the first number is the original node identifier in the regular gen model, the number behind the period is the coordinate to where the block starts. Since we asked to insert the library from coordinate 106 to 539 on the reference path, node 3 is split up into 3.0, 3.106 and 3.159 in the block graph model.
-![visual representation with the actual node IDs](./library_fixed.svg)
+This results in the following output, where the nodes are referred to by their gen identifier in the block graph model
+used when exporting to GFA. In this model, nodes are identified by two numbers separated by a period: the first number
+is the original node identifier in the regular gen model, the number behind the period is the coordinate to where the
+block starts. Since we asked to insert the library from coordinate 106 to 539 on the reference path, node 3 is split up
+into 3.0, 3.106 and 3.159 in the block graph model. ![visual representation with the actual node
+IDs](./library_fixed.svg)
+
+## Searching the library
+We can use a sequence-to-graph mapper like [minigraph](https://github.com/lh3/minigraph?tab=readme-ov-file) to search a
+block group for the presence of a subsequence, traversing all valid edges if needed. Minigraph is a light weight
+application that can be built from source like this:
+```console
+wget "https://github.com/lh3/minigraph/releases/download/v0.21/minigraph-0.21.tar.bz2"
+tar -xzf minigraph-0.21.tar.bz2
+cd minigraph-0.21
+make
+cp minigraph /usr/local/bin/
+```
+
+Queries are entered via a fasta file. If your query is particularly short you will need to tune minigraph's parameters.
+For short queries where you expect an exact match these work well:
+```console
+minigraph -c -n 1,1 -m 1,1 library.gfa query.fa
+```
+## Analysing sequencing data
+### Isolate
+We will also use minigraph to map longread NGS reads obtained from a single colony isolate:
+```console
+minigraph -cx lr library.gfa sample1.fq -o sample1.gaf
+
+[M::main::0.000*8.39] loaded the graph from "library.gfa"
+[M::mg_index::0.002*3.58] indexed the graph
+[M::mg_opt_update::0.002*3.37] occ_max1=50; lc_max_occ=2
+[M::worker_pipeline::0.004*2.59] mapped 10 sequences
+[M::main] Version: 0.21-r606
+[M::main] CMD: minigraph -cx lr -o sample1.gaf library.gfa sample1.fq
+[M::main] Real time: 0.005 sec; CPU: 0.012 sec; Peak RSS: 0.002 GB
+```
+
+The resulting GAF file has the path to which a read maps listed in the 6th column. We can extract all unique paths that
+were identified as follows:
+```console
+cut -f6 sample1.gaf | sort | uniq
+
+<3.539
+<3.539<4.0
+>3.0>8.0>10.0>4.0>3.539
+>3.539
+>4.0>3.539
+```
+
+Not all reads cover the graph from end to end, but by looking at the longest path `>3.0>8.0>10.0>4.0>3.539` we are able
+to identify the genotype of a colony.
+
+### Pool
+Pooled DNA assembly is a great cost-effective way to access a lot of sequence diversity. Instead of making each
+combination of parts in a separate sample during cloning, we add all possible parts to a single tube in a one-pot
+cloning reaction. Analysing the population of sequences obtained from such a reaction is where long-read NGS and graph
+sequence representations really shine.
+
+```console
+minigraph -cx lr library.gfa sample2.fq -o sample2.gaf
+cut -f6 sample1.gaf | sort | uniq
+
+<3.539
+<3.539<3.106
+<3.539<3.106<3.0
+<3.539<4.0
+<3.539<4.0<10.0<6.0<3.0
+<3.539<4.0<10.0<7.0<3.0
+<3.539<4.0<10.0<8.0<3.0
+<3.539<4.0<11.0<5.0<3.0
+<3.539<4.0<11.0<6.0<3.0
+<3.539<4.0<11.0<7.0<3.0
+[...]
+```
+
+As you can see in the output above, there are a lot more unique paths present in this sample. One path in particular you
+may be interested in is `>3.0>3.106>3.539` or its reverse complement `<3.539<3.106<3.0`, which represent the empty
+vector you started out with. For many cloning operations there will always be some carryover of the empty vector. In
+conventional cloning this would be eliminated when you create an isolate by picking a single colony, but in pooled
+sample you can't do that. This usually isn't a problem, as long as the frequency of empty vector is relative low. We can
+measure this by counting the relative occurence of the empty vector paths amongst all observe paths that traverse node
+3.0 and 3.539.
+
+```console
+total_count=$(cut -f6 sample2.gaf | grep '3\.0' | grep '3\.539' | wc -l)
+(.venv) cut -f6 sample2.gaf | grep '3\.0' | grep '3\.539' | sort | uniq -c | awk -v total="$total_count" '{printf "%.2f %s\n", $1 / total * 100, $2}'
+
+27.87 <3.539<3.106<3.0
+1.64 <3.539<4.0<10.0<6.0<3.0
+1.64 <3.539<4.0<10.0<7.0<3.0
+4.92 <3.539<4.0<10.0<8.0<3.0
+1.64 <3.539<4.0<11.0<5.0<3.0
+1.64 <3.539<4.0<11.0<6.0<3.0
+3.28 <3.539<4.0<11.0<7.0<3.0
+3.28 <3.539<4.0<11.0<8.0<3.0
+1.64 <3.539<4.0<11.0<9.0<3.0
+[...]
+```
+
+Here we see that approximately 28% of all molecules in the sample are carryover, which isn't great. In a real sample
+from a Golden Gate cloning reaction for example this will generally be much lower. Note that we haven't taken into
+account any biases to length in this quick analysis.
+
+
+# Appendix
+## Simulating NGS reads using VG
+The NGS data used in this example was simulated using the VG toolkit. For the isolate sample we started from a single
+sequence and converted that into a graph first:
+```
+root@32a61b3f3998:/data# vg construct -r sample1.fa | vg convert --xg-out - > isolate.xg
+root@32a61b3f3998:/data# vg sim -x isolate.xg -n 10 -l 2000 -a | vg view --fastq-out - > sample1.fq
+```
+
+For the pooled sample we use a GFA file exported by gen. VG doesn't handle lowercase nucleotides, so we convert
+everything to uppercase first.
+```
+root@32a61b3f3998:/data# cat library.gfa | tr 'a-z' 'A-Z' > library_allcaps.gfa
+root@32a61b3f3998:/data# vg convert --gfa-in library_allcaps.gfa --xg-out > library.xg
+root@32a61b3f3998:/data# vg sim -x library.xg -n 1000 -l 2000 -a | vg view --fastq-out - > sample2.fq
+```
\ No newline at end of file
diff --git a/examples/combinatorial_plasmid_design/sample1.fq b/examples/combinatorial_plasmid_design/sample1.fq
new file mode 100644
index 0000000..a16d2bb
--- /dev/null
+++ b/examples/combinatorial_plasmid_design/sample1.fq
@@ -0,0 +1,40 @@
+@fc16e671e8ff301a
+TGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAATAATTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGC
++
+????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????
+@c4dfc867a72fd4e3
+GTGGTTTCTTCTACACTCCTAAGACTCGCGAGGCAGAGGACCTGCAAGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAACCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAACGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAATAATTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCG
++
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